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磁微粒發(fā)光反應(yīng)原理與方法詳解!
2024-01-30
文章詳情


化學(xué)發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種測(cè)定方式。該技術(shù)的原理是利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過(guò)氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過(guò)氧化酶-魯米諾衍生物),使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當(dāng)中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會(huì)釋放等能級(jí)的光子,對(duì)光子進(jìn)行測(cè)定而進(jìn)行定量分析(見(jiàn)圖2)?;瘜W(xué)發(fā)光具有熒光的特異性,同時(shí)不需要激發(fā)光,避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度,并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害,是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。


化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù),凡具有抗原性的物質(zhì)(包括半抗原)都可以用CLIA測(cè)定。CLIA起步于80年代初,快速發(fā)展于90年代具備以下特點(diǎn) :

①高度敏感,極限達(dá)10-17-10-19mol/L,遠(yuǎn)高于放射性免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫(EIA)。與時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當(dāng),但比TRFIA便宜。

②特異性強(qiáng),重復(fù)性好CV<10%。

③測(cè)定范圍寬,可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。

④試劑穩(wěn)定性好,無(wú)污染有效期12月。

⑤操作簡(jiǎn)單,易于自動(dòng)化。


磁微?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫分析技術(shù)三者結(jié)合起來(lái)的一種新興分析方法,其基本原理見(jiàn)圖3 。該技術(shù)充分利用了磁性分離技術(shù)的快速易自動(dòng)化性,化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏度性,以及免疫分析的特異性,在生物分析領(lǐng)域展現(xiàn)了不可替代的作用。

圖3. 磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)(雙抗夾心法)原理示意圖

目前磁微?;瘜W(xué)分析免疫分析已經(jīng)應(yīng)用于管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)項(xiàng)目以及電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)項(xiàng)目。


磁珠用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的方法

間接法

間接法就是包被抗原,然后用酶標(biāo)記的抗抗體檢測(cè)樣本中抗體,基本原理見(jiàn)圖4,適合于檢測(cè)對(duì)象是自身抗體的情況。間接法的優(yōu)點(diǎn):相對(duì)較方便,只要變換包被抗原就可以檢測(cè)不同的項(xiàng)目。間接法的缺點(diǎn):標(biāo)本中的特異性抗體會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗原,使結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

圖4. 采用間接法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟:

a)磁性微球表面固定抗原。

b)加入樣本(含目標(biāo)抗體)孵育,清洗。

c)加入酶標(biāo)抗抗體孵育,清洗。

d)加發(fā)光底物,檢測(cè)信號(hào)。


捕獲法

血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在,后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定,因此測(cè)定IgM抗體多用捕獲法。基本原理如圖5所示,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,去除IgG后測(cè)定特異性IgM。

圖5. 采用捕獲法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟:

a)將抗人IgM抗體連接在固相載體上形成固相抗人IgM,洗滌。

b)加入稀釋的血清標(biāo)本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

c)加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結(jié)合洗滌。

d)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體:使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合洗滌。

e)加底物顯色,檢測(cè)信號(hào)。


固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法

競(jìng)爭(zhēng)法,是指受檢抗體和酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)性的與磁珠表面抗原結(jié)合。固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法基本原理如圖6所示。結(jié)合于固相載體的酶標(biāo)抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無(wú)抗體,酶標(biāo)抗體能夠順利與抗原結(jié)合,出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)。若受檢樣本中有抗體,則競(jìng)爭(zhēng)性的占去了酶標(biāo)抗體與抗原的結(jié)合,酶標(biāo)抗體的結(jié)合力減弱,信號(hào)強(qiáng)度減弱。

圖6. 采用固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟:

a)磁珠表面固定特異性抗原。

b)加受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原的混合液孵育。

c)加發(fā)光底物,檢測(cè)信號(hào)。


雙抗夾心(兩步法)

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法,基本原理如圖7所示。

圖7. 采用雙抗夾心法(兩步法)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理

操作步驟:

a)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜。

b)加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)問(wèn),讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

c)加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)。

d)加發(fā)光底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。


雙抗夾心法(一步法

在一步法測(cè)定中,應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hook effect),類(lèi)同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí),過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成夾心復(fù)合物,所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果(如圖8, 雙抗夾心法及雙位點(diǎn)一步法。缺點(diǎn):假陰性)

圖8. 采用雙抗夾心法(一步法)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基本原理


圖9. 采用雙抗夾心法(一步法)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè),當(dāng)樣本中抗原量較多是,容易出現(xiàn)假陰性。

操作步驟:

a)磁珠表面固定一抗。

b)加樣本和酶標(biāo)二抗孵育,清洗。

c)加發(fā)光底物,檢測(cè)信號(hào)。


以上內(nèi)容轉(zhuǎn)自“體外診斷IVD知識(shí)庫(kù)”


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